全网最简单的网络图画法，小白福音包学包会
徐锐（助理研究员），广东省生态环境技术研究所，土壤微生物与宏基因组方向
版本1.0.1，更新日期：2020年6月23日
本项目永久地址：https://github.com/YongxinLiu/MicrobiomeStatPlot ，本节目录 212RareCurve，包含R markdown(*.Rmd)、Word(*.docx)文档、测试数据和结果图表，欢迎广大同行帮忙审核校对、并提修改意见。
背景知识
本教程使用方法
将251NetworkXuRui.zip解压至自己喜欢的目录即可（脚本部分修改成对应的工作目录）。本文件夹包含的子文件夹路径、名字不建议修改，脚本容易报错。
部分脚本可取消#注释，供有需求时使用
默认脚本与案例介绍均采用“微生物OTU丰度-环境理化Ev”的网络关系，可自行调整为“OTU-OTU”模式
重要术语
节点（node/）：基因、物种OTU、环境因子等对象。若为有向网络，则可细分为源节点（Source）和目标节点（Target）。无向网络则不区分。
边（edge/link）：两个节点之间的连线，通常映射为相关性系数（r-value）。还可定义成正/负相关、有/无相关等。
相关性（correlation）：两个节点相关系数的计算结果，根据数据不同可采用不同的模型方法，如常见的Pearson、Spearman、SparCC等。
显著性（significance）：验证相关性是否具有显著性（p-value）。
布局（layout）：节点及边的分布形式，如常见的球形、圆环形、放射形等。
拓扑特性（topological property）：描述网络特征的数学参数，如连接度、中心性、模块数等
网络示意图
简介
网络图（俗称毛线球）是一种广泛用于复杂、高维度数据的分析与可视化方法，常用于表现成百上千个微生物(菌群)、基因、蛋白等对象（统称为特征，feature）之间的关联形式。在网络图中，各个特征被定义为”节点“，而两两特征之间的关系被定义为“相关性”，并以“边”的形式将两个节点进行连接。
简例
幼儿园小朋友们给自己最喜爱的食物打分：
| 小明 | 叮当 | 美美 | |
|---|---|---|---|
| 鸡腿 | 89 | 91 | 20 |
| 牛排 | 95 | 85 | 22 |
| 花椰菜 | 10 | 12 | 84 |
简单观察得分表后可以发现，小明与叮当都比较爱吃肉，而美美则是素食爱好者。那么小明和叮当成为好朋友的可能性可能要比美美更高，用网络图表示就是：
图中：三名小朋友就是节点，对食物的喜爱偏好就是相关性，并且小明和叮当之间的偏好要强于美美，故边也更宽。当然，仅仅根据食物偏好去判断是否能够成为好朋友，可信度不高。因此哪怕相关性很高（边更宽），但其背后的统计意义却不显著，也无法下结论。此外，本例不区分节点的方向，属于无向网络，故三名小朋友既是源节点，也是目标节点。最后，图片的整体分布特征（三角形）就是布局。
实战范例
上述简例为抛砖引玉，实际的数据分析过程远比简例复杂。继续以最常见的微生物菌群丰度（OTU）与环境理化因子（Ev）的网络分析为例进一步说明：
数据准备
环境理化因子数据（data/data_Ev.txt）：行为理化指标，列为各样品
微生物菌群OTU的丰度数据（data/data_OTU.txt）：行为OTU丰度，列为各样品
Ev和OTU的补充注释信息，需手动整理，推荐合成一个表（data/taxonomy.txt）：
注意！
Ev表和OTU表的样品要对应关系要一致
尽量避免行、列名使用非法字符，如#、！、数字开头、空格等，并预先剔除全为0的行/列，常常因为格式不对而报错！
网络的计算
准备工作，安装R包，读取输入文件
# 检测包，是则跳过，没有则安装
if (!requireNamespace("psych", quietly=TRUE))install.packages("psych")
if (!requireNamespace("reshape2", quietly=TRUE))install.packages("reshape2")# 加载包
library(psych)
library(reshape2)# 导入数据(txt)，可在RStudio右上角手动Import Dataset，设置如下
# OTU/Ev文件：heading=Yes, Row names=first column
# Taxonomy文件：heading=Yes, Row names=automatic# 或使用如下命令导入数据：
Ev <- read.table("data/Ev.txt", sep="\t", header=T, row.names=1)
OTU <- read.table("data/OTU.txt", sep="\t", header=T, row.names=1)# 导入节点注释文件
tax <- read.table("data/taxonomy.txt", sep="\t", header=T)
names(tax)[1] <- "Id"数据预处理
# 转置数据格式# # 情形1（默认）：两数据Ev-OTU表格时:
Ev=t(Ev)
OTU=t(OTU)# # 情形2：单数据OTU-OTU表格时：
# OTU=t(OTU)设定分析阈值
结果不理想时可反复修改这些阈值
# 若OTU数目太多，极大影响计算速度，而且结果不具有可读性
# 按丰度值的百分比进行筛选, 默认保留相对丰度>0.05%的OTU
abundance=0.05# 筛选
OTU <- OTU[,colSums(OTU)/sum(OTU)>=(abundance/100)]# 网络分析的关联阈值
r.cutoff=0.6
p.cutoff=0.05开始计算，不用修改
全选脚本后一键Enter~等待自动生成结果吧！超级爽
# 计算r、p# 情形1：两数据Ev-OTU表格时，默认
occor=corr.test(OTU, Ev,use="pairwise",method="spearman", # 可选pearson/kendalladjust="fdr",alpha=0.05)# 情形2：单OTU-OTU
# occor=corr.test(OTU,
# use="pairwise",
# method="spearman",
# adjust="fdr",
# alpha=0.05)# 获取相关矩阵及边数据# 提取相关性矩阵的r、p值
r_matrix=occor$r
p_matrix=occor$p# 确定物种间存在相互作用关系的阈值，将相关性R矩阵内不符合的数据转换为0
r_matrix[p_matrix>p.cutoff|abs(r_matrix)<r.cutoff]=0# 转换数据为长格式形式，方便下游分析
p_value=melt(p_matrix)
r_value=melt(r_matrix)#将r、p两表合并
r_value=cbind(r_value, p_value$value)# 删除含r_value=0的行
r_value=subset(r_value, r_value[,3]!=0)# 删除含r_value=NA的行
r_value=na.omit(r_value)# 对r表格增补绝对值、正负型等信息
abs=abs(r_value$value)linktype=r_value$value
linktype[linktype>0]=1
linktype[linktype<0]=-1r_value=cbind(r_value, abs, linktype)# 重命名r、p表头
names(r_value) <- c("Source","Target","r_value","p_value", "abs_value", "linktype")
names(p_value) <- c("Source","Target","p_value")# 输出结果为csv文件
write.csv(r_value,file="result/1.边数据.csv", row.names=FALSE)
write.csv(r_matrix, file="result/4.corr_matrix.csv")
write.csv(r_value,file="result/5.r_value.csv", row.names=FALSE)
write.csv(p_value,file="result/6.p_value.csv", row.names=FALSE)# 获取节点数据
# 从边文件提取节点并去除重复
node_OTU <- as.data.frame(as.data.frame(r_value[,1])[!duplicated(as.data.frame(r_value[,1])), ])
node_Ev <- as.data.frame(as.data.frame(r_value[,2])[!duplicated(as.data.frame(r_value[,2])), ])names(node_OTU)="Id"
names(node_Ev)="Id"# OTU ID和Ev ID合并成节点索引表，用于检索注释信息
list <- rbind(node_Ev, node_OTU)
write.csv(list,file="result/3.node_list.csv", row.names=FALSE)# 筛选节点对应的注释信息
list=subset(tax,Id %in% list$Id)# 复制一列当节点Label
list$Label <- list$Id# 输出结果为csv文件
write.csv(list,file="result/2.节点数据.csv", row.names=FALSE)查验结果
在result文件夹中查验生成的表格结果，主要使用1.边数据.csv和2.节点数据.csv两个。
1.边数据：
说明：当区分有向、无向网络时，Source和Target节点才有区别。r-value表示符合网络阈值的相关性数值，p-value供说明相关性的显著程度。abs-value是将可正可负的r-value取绝对值，用于画图时表示连线的宽度（关联强度）。linktype表示正（1）、负（-1）相关性，可在画图时用于指定连线的颜色（红=正相关，蓝=负相关）。
2.节点数据：
说明：Id表示边数据中的Source、Target节点，后续几列为节点的注释信息，如分类水平、性别（如有）、采样点等。最后一列Label用于指定画图时节点显示的标签字符，可手动删除不想显示的内容。
疑问？：为什么需要生成节点数据？因为如果直接使用最开始的taxonomy.txt注释文件（总表）画图，会存留许多非网络节点的节点（冗余）。因此需要根据边数据中保留下的节点（符合r/p网络阈值的），从taxonomy总表中挑选出来制作画图用的节点数据（子表）。
网络的可视化
数据在手，天下我有！只要有脚本生成的、或不怕麻烦自己excel手动整理的1.边数据.csv和2.节点数据.csv就可以进行网络图的可视化啦~推荐使用Cytoscape或者Gephi两个软件。以Cytoscape为例：
Cytoscape安装及下载
下载页：https://cytoscape.org/download.html
下载最新版本的Cytoscape和对应的Java环境版本
导入数据
边数据：【File】【Import】【Network from file】【1.边数据.csv】
节点数据：【File】【Import】【Table from file】【2.节点数据.csv】
美化
Cytoscape中可以修改几乎所有能够想到的网络图属性，节点、连线的颜色、粗细、透明度当然不在话下，还可以修改多种布局、标签显示方式，甚至还能计算网络的拓扑参数。由于这部分不是本文重点，不再赘述，具体可参见其他指导手册~
CytoScape网络可视化相关资源：
操作界面介绍
一网打尽
轻松实现
Gephi网络可视化相关资源：
Gephi方法
学术论文案例
厌氧消化反应器中的微生物网络: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0960852418306060 “Organic loading rate and hydraulic retention time shape distinct ecological networks of anaerobic digestion related microbiome”
抗生素抗性基因与潜在宿主网络: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0960852419303281 “Metagenomic analysis reveals the effects of long-term antibiotic pressure on sludge anaerobic digestion and antimicrobial resistance risk”
酸性矿山废水侵蚀下的微生物网络: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0269749119368253 “Uncovering microbial responses to sharp geochemical gradients in a terrace contaminated by acid mine drainage”
责编：刘永鑫，中科院遗传发育所
版本1.0.0，网络基本讲解和网络文件准备
版本1.0.1，改写为Rmd版本，建议作者增加实战讲解和点评、绘图实战的典型操作和经验。
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学习16S扩增子、宏基因组科研思路和分析实战，关注“宏基因组”
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