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samtools是一系列处理bam和sam格式文件的应用程序集合，具有众多的功能。
首先呢，bam和sam文件主要是bwa、bowtie、tophat等序列比对工具产生的，这些软件我们后面会谈到。
软件下载安装：
地址：https://sourceforge.net/projects/samtools/
解压下载后的压缩文件，然后你会看到README文件，里面有详细的安装操作说明。
安装成功后，运行samtools，你会看到：
目前最新版本是1.3.1
下面我们针对samtools的主要命令以及参数做个实例演示。
操作文件下载：
wget http://popgen.dk/software/download/angsd/bams.tar.gz
解压后，在bams文件夹下，你会看到10个bam文件：
名字太复杂，进行批量重命名
rename "s/.mapped.ILLUMINA.bwa.CEU.low_coverage.20111****14.bam//" *
结果如下：
1、view
主要功能：sam和bam文件之间相互转换，针对bam文件进行相关操作。bam文件是sam文件的二进制格式，占据内存较小且运算速度快。
查看view的主要参数：
重要参数释义：
-b：输出bam格式，用于后续分析
-C：输出CRAM文件
-1：快速压缩（需要-b）
-u：输出未压缩的bam文件，节约时间，占据较多磁盘空间（需要-b）
-h：默认输出sam文件不带表头，该参数设定后输出带表头信息
-H：仅仅输出表头信息
-c：仅打印匹配数
-o：输出文件（stdout标准输出）
-U：输出没有经过过滤选择的reads
-t：制表分隔符文件（需要提供额外的参考数据，比如参考基因组的索引）
-L：仅包括和bed文件有重叠的reads
-r：仅输出在STR读段组中的reads
-R：仅输出特定reads
-q：定位的质量大于INT[默认0]
-l：仅输出在STR 库中的reads
-F：获得比对上（mapped）的过滤设置[默认0]
-f：获得未必对上（unmapped）的过滤设置[默认0]
-T：使用fasta格式的参考序列
……
实例演示：
bam文件转换为sam文件
samtools view -h smallNA06985 > test.sam
sam文件转换为bam文件
samtools view -bS -1 test.sam > test.bam
提取比对到参考基因组上的数据
samtools view -bF 4 test.bam > test.F.bam
提取没有比对到参考基因组上的数据
samtools view -bf 4 test.bam > test.f.bam
双端reads都比对到参考基因组上的数据
samtools view -bF 12 test.bam > test.12.bam
单端reads1比对到参考基因组上的数据
samtools view -bF 4 -f 8 test .bam > test1.bam
单端reads2比对到参考基因组上的数据
samtools view -bF 8 -f 4 test.bam > test2.bam
2、sort
主要功能：对bam文件进行排序（不能对sam文件进行排序）
主要参数释义：
-l：设置文件压缩等级，0不压缩，9压缩最高
-m：每个线程运行内存大小（可使用K M G表示）
-n：按照read名称进行排序
-o：排序后的输出文件
-T：PREFIX临时文件前缀
-@：设置排序和压缩的线程数，默认单线程
用法：
samtools sort -l 9 -m 90M -n -o test.sort.bam -T sorted -@ 2 test.bam
上述含义是：压缩最高级9、每一个线程内存90Mb、输出文件名test.sort.bam、临时文件前缀sorted、线程数2。
当然，最简单命令：
samtools sort test.bam -o test.sort.bam
3、index
主要功能：对bam文件建立索引，但在此之前必须进行排序（sort），生成后缀是.bai的文件。
参数释义：
-b：创建一个.bai格式的索引文件（默认）
-c：创建.csi格式的索引文件
-m：创建.csi文件，索引的最小间隔值
用法：
samtools index test.sort.bam
4、merge
功能：合并多个已经sort的bam文件
当有多个样本的bam文件时，可以使用samtools的merge命令将这些bam文件合并为一个排序的且保持所有输入记录并保持现有排序顺序的bam文件。
主要参数释义：
-n：输入根据read排序的文件
-r：RG标签添加到每个比对文件上，标签值来自文件名
-u：输出未压缩的bam文件
-f：覆盖同名文件
-1：压缩等级1
-l：压缩等级0-9
-R：合并输入文件的指定区域
-h：FILE 指定FILE内的’@’头复制到输出bam文件中并替换输出文件的文件头
-c：多个输入文件包含相同的@RG头ID时，只保留第一个到合并后输出的文件
-p：合并的每一个文件中的@PG ID只保留第一个文件中的@PG
-s：覆盖随机种子
-b：文件列表，一行一个
用法：
samtools merge merge.bam smallNA06985.sort smallNA06994.sort
5、faidx
功能：对fasta格式的文件建立索引，后缀名.fai。根据索引文件和序列文件，可以快速提取任意区域的序列文件。
fasta序列格式要求：每条序列，除了最后一行外，其他行的长度必须相同！
为了方便，我们在NCBI上下载水稻NIP基因组的序列，进行演示：
地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=rice
然后，进行解压缩，重命名为seuence.fa
用法：
samtools faidx sequence.fa
最后生成一个sequence.fa.fai索引文件，一共5列，每列之间tab分割。
第一列：序列的名称
第二列：序列长度
第三列：第一个碱基的偏移量，从0开始计数
第四列：除了最后一行外，序列中每行的碱基数
第五列：除了最后一行外，序列中每行的长度（包括换行符）
从中呢，我们可以有目的的提取序列：
提取水稻第一染色体：
samtools faidx sequence.fa Chr1 > Chr1.fa
提取水稻第一染色体100-200bp的序列：
samtools faidx sequence.fa Chr1:100-200 > Chr1_100_200.fa
6、tview
作用：直观显示reads比对到基因组的情况，和基因组浏览器有点类似。
-d：输出类型
-p：直接定位给定位置
-s：reads显示
当给出参考基因组的时候，会在第一排给出参考基因组的序列，否则第一排全用N表示。
首先利用sort进行排序后，在利用index建立索引后，用下面命令：
samtools tview test.sort.bam
具体操作：按下g键，如上界面，有一个Goto对话框，提示输入要到达基因组的某一个位点。在这里，由于没有提供参考基因组，第一排都是N。
我们可以使用H（左）J（上）K（下）L（右）移动显示界面。大写字母移动快，小写字母移动慢。使用空格键向左快速移动，CTRL+H向左移动1KB，CTRL+L向右移动1KB。
此外，可以利用颜色来标注比对质量、碱基质量、核苷酸等。
>=30的碱基质量或比对质量使用白色表示
20-39的用黄色表示
10-19的用绿色表示
0-9的用蓝色表示
使用字母r切换显示read name等。
具体的操作说明可以？键查看。
7、flagstat
作用：reads的比对情况统计
Usage: samtools flagstat [--input-fmt-option OPT=VAL] <in.bam>
用法：
samtools flagstat test.sort.bam
解释：
#总的reads
45456 + 0 in total (QC-passed reads + QC-failed reads)
0 + 0 secondary
0 + 0 supplementary
321 + 0 duplicates
#总体reads比对率
45293 + 0 mapped (99.64% : N/A)
#PEreads
45327 + 0 paired in sequencing
#read1
22670 + 0 read1
#read2
22657 + 0 read2
#PE reads比对到同一条参考序列，并且两条reads之间的距离符合设置的阈值
44950 + 0 properly paired (99.17% : N/A)
#PE中两条都比对到参考序列上的reads数
45001 + 0 with itself and mate mapped
#单独一条匹配到参考序列上的reads数，和上一个相加，则是总的匹配上的reads数。
163 + 0 singletons (0.36% : N/A)
#PE中两条分别比对到两条不同的参考序列的reads数
23 + 0 with mate mapped to a different chr
#PE中两条分别比对到两条不同的参考序列的reads数（比对质量>=5）
11 + 0 with mate mapped to a different chr (mapQ>=5)
8、depth
作用：每个碱基位点的测序深度
-a：输出所有的碱基深度（包括0）
-b/-r：控制深度的范围（后面跟染色体）
-f：bam文件名字
-l：设置read长度阈值
-d/-m：最大覆盖深度
-q：碱基质量阈值
-Q：比对质量阈值
samtools depth -a -r 3 test.sort.bam
结果是tab分割的三列
第一列：染色体名称
第二列：碱基位置
第三列：测序深度
9、mpileup
作用：对参考基因组每个位点做碱基堆积，用于call SNP和INDEL。主要是生成BCF、VCF文件或者pileup一个或多个bam文件。比对记录以在@RG中的样本名作为区分标识符。如果样本标识符缺失，那么每一个输入文件则视为一个样本。
主要参数释义：
-A：在检测变异中，不忽略异常的reads对
-C：用于调节比对质量的系数，如果reads中含有过多的错配，不能设置为零
-D：输出每个样本的reads深度
-l：BED文件或者包含区域位点的位置列表文件
注意：位置文件包含两列，染色体和位置，从1开始计数。BED文件至少包含3列，染色体、起始和终止位置，开始端从0开始计数。
-r：在指定区域产生pileup，需已建立索引的bam文件，通常和-l参数一起使用
-o/g/v：输出文件类型（标准格式文件或者VCF、BCF文件）
-t：设置FORMAT和INFO的列表内容，以逗号分割
-u：生成未压缩的VCF和BCF文件
-I：跳过INDEL检测
-m：候选INDEL的最小间隔的reads
-f：输入有索引文件的fasta参考序列
-F ：含有间隔reads的最小片段
……
用法：
生成一个简单的vcf文件
samtools mpileup -vu test.sort.bam
如果有参考基因组的话
samtools mpileup -vuf genome.fasta test.sort.bam
10、dict
作用：建立参考基因组字典
用法：
samtools dict test.sort.bam sequences.fa
11、cat
作用：连接多个bam文件（不做排序）
Usage: samtools cat [-h header.sam] [-o out.bam] <in1.bam> [...]
用法：
samtools cat -o out.bam smallNA06985 smallNA06994
12、split
作用：根据read group 分割bam文件
用法：
samtools split test.sort.bam
13、quickcheck
作用：检查SAM/BAM/CRAM文件的完整性
用法：
samtools quickcheck -v *.bam > bad_bams
14、fastq
作用：bam文件转换为fastq
用法：
samtools fastq test.bam
15、fasta
作用：bam文件转换为fasta
用法：
samtools fasta test.bam
16、idxstats
作用：检索和打印与输入文件相对应的index file里的统计信息
Usage: samtools idxstats <in.bam>
用法：
samtools idxstats test.sort.bam
结果返回一个表格，4列。
第一列：序列名
第二列：序列长度
第三列：比对上的reads数
第四列：未必对数目
17、stats
作用：对bam文件做详细统计,其统计结果可用mics/plot-bamstats作图
用法：
samtools stats test.bam
输出的信息比较多，部分如下：
Summary Numbers，raw total sequences，filtered sequences, reads mapped, reads mapped and paired,reads properly paired等信息
Fragment Qualitites：根据cycle统计每个位点上的碱基质量分布
Coverage distribution：深度为1，2，3，，，的碱基数目
ACGT content per cycle：ACGT在每个cycle中的比例
Insert sizes：插入长度的统计
Read lengths：read的长度分布
18、reheader
作用：替换bam文件的头
用法：
samtools view -H test.bam > in.header.bam
samtools reheader -p -i in.header.bam test.bam
19、rmdup
作用：将由PCR duplicates 获得的reads去掉，并保留高比对质量的reads
用法：
samtools rmdup -sS test.bam output.bam
20、phase
作用：call杂合SNP，确定相位
用法：
samtools phase test.bam
21、calmad
作用：计算MD tag（a optional field，记录了mismatch信息）
用法：
samtools calmd test.bam sequences.fa
